1901年，Emil Fischer首次用酸水解二酮哌嗪法合成二肽，标志着液相合成多肽的开始。虽然现在固相合成在多肽合成中占据主导地位，但液相合成肽仍然是制备多肽甚至蛋白质的主要方法。今天，大多数多肽药物的商业化制备仍然是用经典的液相合成法合成。已经使用的氨基保护基很多，但归纳起来，可以分为烷氧羰基、酰基和烷基三大类。烷氧羰基使用最多，原因是N-烷氧羰基保护的氨基酸在接肽时不易发生消旋。

一、烷氧羰基保护剂

1.1、苄氧羰基（Cbz）

苄氧羰基（Cbz）是1932年Bergmann发现的一个很老的氨基保护基，但一直到今天还在应用。其优点在于：试剂的制备和保护基的导入都比较容易；N-苄氧羰基氨基酸和肽易于结晶而且比较稳定；苄氧羰基氨基酸在活化时不易消旋；能用多种温和的方法选择性地脱去。

1.1.1 苄氧羰基的导入

苄氧羰基的导入，一般都是用Cbz-Cl。游离氨基在用NaOH 或NaHCO3 控制的碱性条件下可以很容易同Cbz-Cl反应得到N-苄氧羰基氨基化合物。α,β-二胺可用该试剂在pH= 3.5-4.5稍有选择性地被保护，其选择性随碳链地增长而减弱，如H2N(CH2)nNH2, n=2时71%被单保护; n=7时29%被单保护。 氨基酸酯同Cbz-Cl的反应则是在有机溶剂中进行，并用碳酸氢盐或三乙胺来中和反应所产生的HCl。此外，Z-ONp、Z-OSu等苄氧羰基活化酯也可用来作为苄氧羰基的导入试剂。

1.1.2 苄氧羰基的脱去 

苄氧羰基的脱除主要有以下几种方法：1). 催化氢解；2). 酸解裂解；3). Na/NH3（液）还原。 一般而言目前实验室常用简洁的方法就是催化氢解， 但当分子中存在对催化氢解敏感或钝化的基团时，我们就必须采用化学方法如酸解裂解或Na/NH3（液）还原等。 

1.2、叔丁氧羰基（Boc）

除Cbz保护基外，叔丁氧羰基（Boc）也是目前多肽合成中广为采用的氨基保护基，特别是在固相合成中，氨基的保护用Boc而多不用Cbz。Boc具有以下的于的优点：Boc-氨基酸除个别外都能得到结晶；易于酸解除去，但有具有一定的稳定性，Boc-氨基酸能较长期的保存而不分解；酸解时产生的是叔丁基阳离子再分解为异丁烯，它一般不会带来副反应；对碱水解、肼解和许多亲核试剂稳定；Boc对催化氢解稳定，但比Cbz对酸要敏感得多。当Boc和Cbz同时存在时，可以用催化氢解脱去Cbz，Boc保持不变，或用酸解脱去Boc而Cbz不受影响，因而两者能很好地搭配。

1.2.1 叔丁氧羰基的导入

游离氨基在用NaOH 或NaHCO3 控制的碱性条件下用二氧六环和水的混合溶剂中很容易同Boc2O反应得到N-叔丁氧羰基氨基化合物。这是引入Boc常用方法之一，它的优点是其副产物无多大干扰并容易除去。有时对一些亲核性较大的胺，一般可在甲醇中和Boc酸酐直接反应即可，无须其他的碱，其处理也方便。

1.2.2 叔丁氧羰基的脱去

Boc比Cbz对酸敏感，酸解产物为异丁烯和CO2（见下式）。在液相肽的合成中，Boc的脱除一般可用TFA或50%TFA（TFA:CH2Cl2 = 1:1,v/v）。而在固相肽合成中，由于TFA会带来一些副反应（如在得到的胺上上一个三氟乙酰基等），因此多采用1-2M HCl/有机溶剂。一般而言用HCl/二氧六环，比较多见。

1.3、芴甲氧羰基（Fmoc）

Fmoc保护基的一个主要的优点是它对酸极其稳定，在它的存在下，Boc和苄基可去保护。Fmoc的其他优点是它较易由简单的胺不通过水解来去保护，被保护的胺以游离碱释出[1]。一般而言Fmoc对氢化稳定，但某些情况下，它可用H2/Pd-C在AcOH和MeOH仲脱去。Fmoc保护基可与酸脱去的保护基搭配而用于液相和固相的肽合成.

1.3.1 芴甲氧羰基的导入

芴甲醇在无水CH2Cl2中与过量的COCl2反应可以得到很好产率的Fmoc-Cl（熔点61。5-63℃），所得Fmoc-Cl在二氧六环/Na2CO3或NaHCO3溶液同氨基酸反应则可得到Fmoc保护的氨基酸。在用Fmoc-Cl引入Fmoc的过程中二异丙基乙胺可抑制二肽的生成。或用Fmoc-OSu在乙腈/水中导入，该方法在制备氨基酸衍生物时很少低聚肽生成。

1.3.2 芴甲氧羰基的脱去

Fmoc同前面提到的Cbz和Boc不同，它对酸稳定，较易由简单的胺不通过水解来去保护，被保护的胺以游离碱释出。

Fmoc-ValOH在DMF中用不同的胺碱去保护的快慢有较大的差异，20%的哌啶较快。Fmoc保护基一般也能用浓氨水、二氧六环/4M NaOH(30:9:1)以及用哌啶、乙醇胺、环己胺、吗啡啉、吡咯烷酮、DBU等胺类的50%CH2Cl2的溶液脱去。另外，Bu4N+F-/DMF在室温的脱去效果也很好。叔胺（如三乙胺）的脱去效果较差，具有空间位阻的胺的脱除效果最差。

二、酰基保护剂

2.1、三氟乙酰基（Tfa）

Tfa是1952年由Weygand最先引入到多肽中的。Tfa保护的氨基酸或肽酯在高真空下易于气化，因而能用于气相层析以检测消旋的程度和测定天然肽的排列顺序，而且由于含有F，也可以用来检测合成肽的纯度、消旋程度及类似物的测定等。

2.1.1 三氟乙酰基的导入

Tfa的导入试剂为三氟乙酸酐，它可由三氟乙酸用P2O5脱水合成。由于三氟乙酸酐同氨基酸反应时易生成噁唑烷酮而发生消旋，因此，同甲酰基的导入一样，在低温下于TFA溶液中用三氟乙酸酐酰化为好。

2.1.2 三氟乙酰基的脱除

Tfa可以在水或乙醇水溶液中用0.1~0.2mol/L NaOH处理或者用1mol/L哌啶溶液处理很容易脱去。由于脱去的方法温和，也适用于某些长肽链中的Tfa基的脱去。

2.2、邻硝基苯巯基（Nps）

邻硝基苯巯基是1963年由车尔伐斯等提出来的。Nps保护的一个主要缺点是Nps-氨基酸和Nps-肽不易结晶，而且Nps-肽总是带有黄色，即使在脱去Nps以后，也很难得到无色的产物。

2.2.1 邻硝基苯巯基的导入

Nps的特点是它比Boc更易被酸脱去，而且导入试剂Nps-Cl的合成比较方便，价格也便宜。将Nps-Cl同氨基酸在碱性条件下反应很容易合成Nps-氨基酸，不过由于它自身羧基的酸性会导致Nps的缓慢分解，因此一般是以二环己胺盐的形式保存。Nps还可以高分子的形式（Ⓟ-Nps-Cl）来保护氨基。

2.2.2 邻硝基苯巯基的脱除

Nps很容易被酸解脱去，当用2mol/L HCl水解时，其脱去的速度比Boc要快70倍，若用HCl的有机溶液，则只要2当量的HCl就足以完全脱除Nps。采用这个条件，可以在Boc和叔丁酯（或醚）基存在的情况下，选择性的只脱去Nps。

2.3、对甲苯磺酰基（Tos）

对甲苯磺酰胺由胺和对甲苯磺酰氯在吡啶或水溶性碱存在下制得的，它是最稳定的氨基保护基之一，对碱性水解和催化还原稳定。碱性较弱的胺如吡咯和吲哚形成的对甲苯磺酰胺比碱性更强的烷基胺所形成的对甲苯磺酰胺更易去保护，可以通过碱性水解去保护，而后者通过碱性水解去保护是不可能的。对甲苯磺酰胺一个很有吸引力的性质是这些衍生物的酰胺或氨基甲酸酯更容易形成结晶。除在早期作过α-氨基的保护基外，一般都是用作碱性氨基酸的侧链保护基。

2.3.1对甲苯磺酰基的引入

对甲苯磺酰氯在NaOH、NaHCO3或其他有机碱存在下同氨基酸、吡咯和吲哚等反应很容易得到良好产率的Tos-衍生物

2.3.2对甲苯磺酰基的脱去

Tos非常稳定，它经得起一般酸解(TFA和HCl等）、皂化、催化氢解等多种条件得处理比受影响，常用萘钠、Na/NH3(液)  和 Li/NH3(液)处理脱去。HBr/苯酚和Mg/MeOH也是比较好的去保护方法。值得注意的是，Na/NH3(液)的操作比较麻烦，并且会引起一些肽键的断裂和肽链的破坏。另外，有时HF/MeCN回流也能脱去Tos基。

2.4、邻苯二甲酰基（Pht）

同一般的酰基氨基酸比较，Pht-氨基酸在接肽时不易消旋，但它对碱不稳定，在碱皂化的条件下发生邻苯二甲酰亚胺环的开环生成邻羧基苯甲酰基衍生物[1]。因此，当选用Pht作氨基保护基时，肽链的羧基末端则不能用甲酯（或乙酯）保护，而只能用苄酯或叔丁酯保护，以避免将来用皂化去酯的步骤。Pht对催化氢解、HBr/HOAc处理以及Na/NH3（液）还原（后处理的碱性条件需要避免）等均稳定，但很容易用肼处理脱去。

2.4.1邻苯二甲酰基的引入

最先导入Pht基的方法是将邻苯二甲酸酐同氨基酸在145-150℃进行熔融反应，但这个方法对有的氨基酸会引起部分消旋作用，因而后来又进行了一些改进，如邻苯二甲酸酐/CHCl3/70℃下反应。然而最成功的是Nefkens提出的用N-乙氧羰基邻苯二甲酰亚胺为试剂的方法（见下式），即N-乙氧羰基邻苯二甲酰亚胺与氨基酸在Na2CO3水溶液仲于25℃反应10-15分钟，就可以得到85-95%的Pht-氨基衍生物。这个试剂可在仲胺的存在的情况下选择性地保护伯胺.

2.4.2邻苯二甲酰基的脱去

Pht-氨基衍生物很容易用肼处理脱去。一般用水合肼的醇溶液回流2小时或用肼的水或醇溶液室温放置1-2天都可完全脱去Pht保护基。在此条件下Cbz、Boc、甲酰基、Trt、Tos等均可不受影响。在肼效果差的情况下，NaBH4/i-PrOH-H2O(6:1)和AcOH在80℃反应5-8小时，这个方法是很有效的。另外，浓HCl回流也容易脱去Pht保护基。

3.     烷基保护剂

3.1、三苯甲基（Trt）

三苯甲基（Trt）是50年代开始用于多肽合成的，现在体积大的Trt被用于保护各种氨基，如氨基酸、青霉素、头孢霉素等。N-Trt-α-氨基酸的酯不能发生水解，需要较强的去保护条件，α-质子同样不易被脱去，这意味着，在分子中其他地方的酯可以选择性的水解。

Trt的立体位阻的影响还表现在接肽反应中，Trt-氨基酸（除Trt-Gly和Trt-Ala以外）一般不能采用混合酸酐法接肽，Trt-氨基酸的酯不能水解，也就不能用叠氮法接肽，而只能采用DCC这类方法来接肽。但Trt的立体位阻只表现在对Trt-氨基酸的反应影响上，Trt-肽则不存在这个问题，因此对长链肽的末端氨基的保护来说，Trt还是可用的，特别是对于带有含硫氨基酸的肽来说，由于不能采用催化氢解来实现Cbz和Boc之间的选择性脱去，采用Trt则将有其有利之处。

3.1.1三苯甲基的引入

由于Trt有很大的立体位阻，除氨基酸侧链很小的Trt-甘氨酸酯以外，一般的Trt-氨基酸酯都难以皂化，而用很强烈的条件（如高温）则有引起消旋的危险。因此Trt的引入一般是采用以下反应来实现的。

3.1.2三苯甲基的脱去

Trt容易用酸脱去，如用HOAc或50%（或75%）HOAc的水溶液在30℃或回流数分钟顺利除去。这时N-Boc和O-But可以稳定不动。其他如HCl/MeOH、HCl/CHCl3、HBr/HOAc和TFA都能很方便的脱去Trt，用HCl/MeOH处理Trt-Lys(Trt)OCH3可以得到Lys(Trt)OCH3，说明侧链上的Trt比α-Trt 对酸更稳定一些。Cys(Trt)、His(Trt)和Try(Trt)等的侧链上的N-Trt比Nα-Trt 对酸稳定，因此可以采用适当的酸解条件选择性脱去Nα-Trt而保留侧链上的N-Trt。

南京华焱化学有限公司专业生产销售氨基酸保护剂和缩合剂，如有需求，欢迎垂询，电话：025-86661363。